奶牛乳腺炎应激条件下乳中脂肪酸变化及其调控

【摘要】奶牛乳腺炎是当今世界对奶牛业危害最大的疾病之一,常规的接种疫苗等预防措施通常达不到效果,通过遗传选择提高奶牛乳腺炎抗性(抗乳腺炎育种)被认为是解决乳腺炎问题的一种治本的策略。研究表明病原微生物感染是引起奶牛乳腺炎发生的最主要致病因素,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为主要的病原菌之一。金黄色葡萄球菌具有很强的致病性,主要是由于它能产生多种毒素和酶,其毒力因子包括肠毒素、杀白细胞素以及溶血素。本研究在揭示奶牛隐性乳腺炎乳中脂肪酸含量变化基础上,对乳中不饱和脂肪酸合成关键基因SCD1基因多态性与乳中脂肪酸含量进行了分析；利用金黄色葡萄球菌(ATCC29213)人工侵染到中国荷斯坦奶牛乳腺中,并观测人工感染后奶牛的全身反应,同时通过乳腺炎临床诊断、细菌检测以及乳腺组织病理学检查等一系列试验,确定奶牛乳腺炎模型的成功构建,进而运用Agilent表达谱基因芯片分析了金黄色葡萄球菌人工诱导奶牛实验性乳腺炎的基因表达谱差异,对差异基因进行GO和Pathway等功能分析,构建脂肪酸基因调控网络,同时利用Q-PCR对芯片结果进行验证；进一步探索奶牛乳腺炎对乳成份及乳中脂肪酸组成的影响,为针对奶牛乳中脂肪酸含量的标记辅助选择提供参考依据。本试验主要研究结果如下：1.以扬州地区规模化养殖场的154头中国荷斯坦奶牛为研究对象,利用乳腺炎测试法(BeijingMastitisTest,BMT)判断奶牛隐性乳腺炎的发病程度,检测结果发现：46头奶牛正常,37头患有弱阳性(+),31头患有阳性(++),40头患有强阳性(+++)。通过不同乳腺炎程度乳中22种脂肪酸含量与正常乳进行比较,发现随着隐性乳腺炎程度的加重,C14:1,C15:0和C15：1的含量较其他脂肪酸含量发生了较明显的变化。其次通过对C14指数、C15指数、C16指数、C18指数、C24指数、SFA、MUFA、PUFA、MCFA、LCFA进行分析比较,C14指数在正常乳、弱阳性(+)、“++”与强阳性(+++)之间差异极显著(P<0.01),C15指数正常乳与阳性(++)、“+++”之间差异显著(P<0.05),SFA在正常乳与阳性(++)、“+++”之间差异极显著(P<0.01),MUFA在正常乳与强阳性(+++)之间差异显著(P<0.05)。2.在扬州大学实验农牧场采集323头荷斯坦牛血样,并对其中140头乳样进行了脂肪酸测定,进一步分析SCD1外显子5遗传基因多态性及其对乳中不饱和脂肪酸含量及其不饱和指数的影响。发现SCD1-702位点无多态,SCD1-762和SCD1-878分别发现T/C和C/T两个突变。SCD1-762位点A为优势等位基因,基因频率为0.7897。SCD1-878位点C为优势基因,频率为0.7835。SCD1-762与%SCD1-878处于极显著连锁不平衡,连锁不平衡系数r2为0.879，SCD1-762、SCD1-878及其单倍型对MUFA比例及总不饱和指数的影响均达到显著水平(P<0.05),SCD1-878TT型、SCD1-762BB型和SCD1-762-878BT型乳中MUFA比例及总不饱和脂肪酸指数显著低于其它基因型或单倍型。这表明SCD1878和762位点突变对乳中乳脂肪酸组成及不饱和指数有显著的遗传效应,可作为影响中国荷斯坦奶牛乳脂肪酸组成的重要候选基因进一步深入研究。3.利用金黄色葡萄球菌进行人工侵染中国荷斯坦奶牛乳腺,构建奶牛临床型乳腺炎疾病模型。通过分析金黄色葡萄球菌感染前后乳中脂肪酸组成及其比例的变化,发现感染前后棕榈酸(C16：0)含量最高,在所有检测脂肪酸中的比例超过30%,其次是油酸(C18：1c),所占比例超过20%。C20:2、C20:3、C20:4、C20:5和C22：6等长链多不饱和脂肪酸的含量较低,C22：6在感染前后不同时间变化明显,金葡菌感染后的牛奶中的C22：6含量急剧下降。同时发现感染后对C20指数、MUFA含量、PUFA含量以及mc-FA含量均造成了显著影响。4.表达谱基因芯片分析共筛选出显著差异表达基因3271个,其中上调2057个,下调1214个,GO分析发现,显著性参与生物过程(BiologicalProcess)的基因257个,细胞组成(CellularComponent)的基因41个以及分子功能(MolecularFunction)的基因73个,Pathway分析发现差异基因参与了22个显著性pathway。从中挑选出3个脂肪相关通路：脂肪酸代谢(Fattyacidmetabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesisofunsaturatedfattyacids)和脂肪酸生物合成(Fattyacidbiosynthesis),并发现脂肪相关差异基因15个,6个上调(DGAT2、SLC27A6、FABP2、FADS2、PLP1、SCD),9个下调(ACAT2、ELOVL5、PAPPA、ACOX3、ALDH3A2、EHHADH、FASN、LPL、SREBF1),并用荧光定量PCR对10个脂肪酸相关基因进行了验证,结果与芯片结果基本一致；构建了脂肪酸相关基因网络调控图。
【作者】王小龙；
【导师】杨章平；毛永江；
【作者基本信息】扬州大学，畜产品安全生产与加工工程，2014，博士
【关键词】荷斯坦奶牛；乳腺炎；脂肪酸；金黄色葡萄球菌；基因芯片；SCD1基因；

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